Gram-Färbung (mit Bildern)

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Gram-Färbung (mit Bildern)
Gram-Färbung (mit Bildern)
Anonim

Die Gram-Färbung ist ein schnelles Verfahren, mit dem nach Bakterien in Gewebeproben gesucht und Bakterien anhand der chemischen und physikalischen Eigenschaften ihrer Zellwände als gram-positiv oder gram-negativ charakterisiert werden können. Die Gram-Färbung sollte fast immer als erster Schritt bei der Diagnose einer Bakterieninfektion durchgeführt werden.

Die Gram-Färbung ist nach dem dänischen Wissenschaftler Hans Christian Gram (1853 – 1938) benannt, der die Technik 1882 entwickelt und 1884 veröffentlicht hat, um zwischen zwei Bakterienarten mit ähnlichen klinischen Symptomen zu unterscheiden: Streptococcus pneumoniae (auch bekannt als Pneumokokken) und Klebsiella pneumoniae-Bakterien.

Schritte

Teil 1 von 3: Vorbereitung einer Gram-Färbung

Gram-Färbung Schritt 1

Schritt 1. Bereiten Sie sich auf die Laborarbeit vor

Ziehen Sie Handschuhe an und binden Sie lange Haare zurück, um eine Kontamination der zu testenden Bakterienprobe zu vermeiden. Desinfizieren Sie einen Arbeitsbereich unter dem Abzug oder in einem anderen gut belüfteten Bereich. Überprüfen Sie die Funktionsfähigkeit von Bunsenbrenner und Mikroskop, bevor Sie beginnen.

Gram-Färbung Schritt 2

Schritt 2. Sterilisieren Sie einen Objektträger aus Glas

Wenn der Objektträger verschmutzt ist, waschen Sie ihn in Seifenwasser, um Fett und Schmutz zu entfernen. Desinfizieren Sie den Objektträger mit Ethanol, Glasreiniger oder einer anderen von Ihrem Labor empfohlenen Methode.

Gram-Färbung Schritt 3

Schritt 3. Fügen Sie die Probe der Folie hinzu

Sie können die Gram-Färbungsmethode verwenden, um Bakterien in medizinischen Proben oder in einer Petrischale gezüchteten Bakterienkulturen zu identifizieren. Damit die Gram-Färbung nützlich ist, fügen Sie a. hinzu dünn Schicht der Probe auf den Fleck. Eine Probe, die weniger als 24 Stunden alt ist, wird empfohlen, da ältere Bakterien beschädigte Zellwände haben können, die weniger vorhersehbar auf Gram-Färbung reagieren.

  • Bei Verwendung einer Gewebeprobe 1–2 Tropfen auf den Objektträger geben. Verteilen Sie es gleichmäßig auf dem Objektträger, um einen dünnen Ausstrich zu bilden, indem Sie den Rand eines zweiten sterilisierten Glasobjektträgers verwenden. Lassen Sie es an der Luft trocknen, bevor Sie fortfahren.
  • Wenn Sie Bakterien aus einer Petrischale entnehmen, sterilisieren Sie eine Impföse in einer Bunsenbrennerflamme, bis sie glüht, und lassen Sie sie dann abkühlen. Geben Sie damit einen Tropfen steriles Wasser auf den Objektträger, sterilisieren und kühlen Sie die Schlaufe erneut, bevor Sie eine winzige Bakterienprobe übertragen und vorsichtig in das Wasser einrühren.
  • Bakterien in der Brühe sollten in einem Vortexer gemischt und dann wie oben mit einer Impföse hinzugefügt werden, ohne zusätzliches Wasser hinzuzufügen.
  • Wenn Sie eine Tupferprobe haben, rollen Sie den Tupfer leicht über den Objektträger.
Gram-Färbung Schritt 4

Schritt 4. Fixieren Sie den Ausstrich mit Hitze

Hitze fixiert die Bakterien auf dem Objektträger, sodass sie während des Färbens nicht so leicht abgespült werden. Führen Sie den Objektträger zwei- bis dreimal schnell durch eine Bunsenbrennerflamme oder erhitzen Sie ihn auf einem elektrischen Objektträgerwärmer. Nicht überhitzen, sonst können die Proben verzerrt werden. Wenn Sie einen Bunsenbrenner verwenden, sollte die Flamme ein kleiner blauer Kegel sein, kein hoher oranger.

Alternativ kann der Ausstrich stattdessen durch Methanol fixiert werden, indem 1-2 Tropfen Methanol auf den getrockneten Ausstrich gegeben, überschüssiges Methanol abgelassen und an der Luft trocknen gelassen wird. Diese Methode minimiert Schäden an Wirtszellen und ergibt einen saubereren Hintergrund

Gram-Färbung Schritt 5

Schritt 5. Positionieren Sie den Objektträger auf einem Färbetablett

Eine Färbeschale ist eine flache Schale aus Metall, Glas oder Kunststoff mit einer kleinen Gitter- oder Drahtstütze, die über die Oberseite läuft. Legen Sie den Objektträger auf diese Unterlage, damit die Flüssigkeiten, die Sie verwenden, in das Tablett abfließen können.

Wenn Sie keine Färbeschale haben, kann der Objektträger direkt auf eine Eiswürfelschale aus Kunststoff gelegt werden

Teil 2 von 3: Durchführung der Gram-Färbung

Gram-Färbung Schritt 6

Schritt 1. Fluten Sie den Ausstrich mit Kristallviolett

Verwenden Sie eine Pipette, um die Bakterienprobe mit mehreren Tropfen Kristallviolett-Farbstoff, manchmal auch Gentianaviolett genannt, zu überfluten. Warten Sie dreißig bis sechzig Sekunden. Kristallviolett (CV) dissoziiert in wässrigen Lösungen in CV+ und Chlorid (Cl–) Ionen. Diese Ionen dringen durch die Zellwand und die Zellmembran von sowohl grampositiven als auch gramnegativen Zellen. Das CV+-Ion interagiert mit negativ geladenen Komponenten von Bakterienzellen, um die Zellen lila zu färben.

Viele Labors verwenden "Huckers" Kristallviolett, das Ammoniumoxalat hinzufügt, um Ausfällungen zu verhindern

Gram-Färbung Schritt 7

Schritt 2. Spülen Sie das Kristallviolett vorsichtig ab

Kippen Sie den Objektträger und spritzen Sie mit einer Waschflasche einen kleinen Strahl destilliertes oder Leitungswasser über den Objektträger. Das Wasser sollte über die Oberfläche des Abstrichs herunterlaufen, aber nicht direkt darauf gerichtet sein. Nicht übermäßig spülen, da dies den Fleck von grampositiven Bakterien entfernen könnte.

Gram-Färbung Schritt 8

Schritt 3. Fluten Sie den Abstrich mit Jod und spülen Sie ihn dann aus

Bedecken Sie den Ausstrich mit einer Pipette mit Jod. Lassen Sie es mindestens 60 Sekunden einwirken und spülen Sie es dann mit der gleichen sorgfältigen Methode ab. Jod in Form von negativ geladenen Ionen interagiert mit CV+, um große Komplexe aus Kristallviolett und Jod (CV-I-Komplexe) innerhalb der inneren und äußeren Schichten der Zelle zu bilden. Dadurch wird die violette kristallviolette Farbe in der Zelle eingeschlossen, wo immer sie gefärbt ist.

Jod ist ätzend. Einatmen, Verschlucken oder Hautkontakt vermeiden

Gram-Färbung Schritt 9

Schritt 4. Fügen Sie ein Entfärbemittel hinzu und spülen Sie es dann schnell aus

Für diesen kritischen Schritt wird typischerweise eine 1:1-Mischung aus Aceton und Ethanol verwendet, die sorgfältig zeitlich abgestimmt werden muss. Halten Sie den Objektträger schräg, dann geben Sie den Entfärber hinzu, bis im abfließenden Ablauf keine violette Farbe mehr sichtbar ist. Dies dauert in der Regel weniger als 10 Sekunden oder sogar noch kürzer, wenn der Entfärber höhere Acetonkonzentrationen enthält. Stoppen Sie sofort, oder der Entfärber entfernt die Kristallviolettfärbung sowohl von grampositiven als auch gramnegativen Zellen und die Färbung muss wiederholt werden. Überschüssiges Entfärbemittel sofort mit der früheren Technik abspülen.

  • Stattdessen kann reines (95 %+) Aceton verwendet werden. Je mehr Aceton vorhanden ist, desto schneller arbeitet der Entfärber und erfordert ein genaueres Timing.
  • Wenn Sie bei diesem Schritt Probleme beim Timing haben, sollten Sie den Entfärber tropfenweise hinzufügen.
Gram-Färbung Schritt 10

Schritt 5. Den Ausstrich mit Gegenfärbung überfluten und dann ausspülen

Eine Gegenfärbung, typischerweise Safranin oder Fuchsin, wird verwendet, um einen zusätzlichen Kontrast zwischen gramnegativen und grampositiven Bakterien hinzuzufügen, indem entfärbte (gramnegative) Bakterien rosa oder rot gefärbt werden. Lassen Sie es mindestens 45 Sekunden einwirken und spülen Sie es dann ab.

Fuchsin färbt viele gramnegative Bakterien intensiver, wie zB Haemophilus spp und Legionella spp. Dies kann es zu einer besseren Option für Anfänger machen

Gram-Färbung Schritt 11

Schritt 6. Trocknen Sie den Objektträger

Sie können den Objektträger an der Luft trocknen lassen oder ihn mit saugfähigem Papier, das für diesen Zweck verkauft wird, trocken tupfen. Die Gram-Färbung ist abgeschlossen.

Teil 3 von 3: Untersuchung des Ergebnisses

Gram-Färbung Schritt 12

Schritt 1. Bereiten Sie das Lichtmikroskop vor

Legen Sie den Objektträger unter das Lichtmikroskop. Bakterien variieren stark in der Größe, so dass die erforderliche Gesamtvergrößerung von 400x bis 1000x variiert. Am oberen Ende dieser Vergrößerungen wird ein Ölimmersionsobjektiv für mehr Klarheit empfohlen. Geben Sie einen Tropfen Immersionsöl auf den Objektträger und vermeiden Sie Bewegungen während des Auftragens, um Blasen zu vermeiden. Bewegen Sie den Mikroskoprevolver so, dass die Objektivlinse einrastet und das Öl berührt.

Ölimmersion kann nur bei speziell entwickelten Linsen verwendet werden, nicht bei "trockenen" Linsen

Gram-Färbung Schritt 13

Schritt 2. Identifizieren Sie grampositive und gramnegative Bakterien

Untersuchen Sie den Objektträger unter dem Lichtmikroskop. Gram-positive Bakterien erscheinen aufgrund des Kristallvioletts, das in ihren dicken Zellwänden eingeschlossen ist, violett. Gram-negative Bakterien erscheinen rosa oder rot, da das Violett durch die dünnen Zellwände gespült wurde und dann die rosa Gegenfärbung in sie eindrang.

  • Wenn die Probe zu dick ist, werden möglicherweise falsch positive Ergebnisse angezeigt. Färben Sie eine neue Probe, wenn alle Bakterienarten grampositiv sind, um sicherzustellen, dass das Ergebnis korrekt ist.
  • Wenn der Entfärber zu lange gelaufen ist, werden möglicherweise falsch negative Ergebnisse angezeigt. Färben Sie eine neue Probe, wenn alle Bakterientypen gramnegativ sind, um Ihre Ergebnisse zu überprüfen.
Gram-Färbung Schritt 14

Schritt 3. Suchen Sie nach Referenzbildern

Wenn Sie sich nicht sicher sind, was ein Bakterium ist, sehen Sie sich eine Sammlung von Referenzbildern an, sortiert nach Form und Ergebnis der Gram-Färbung. Sie finden Datenbanken online bei der National Microbial Pathogen Database und vielen anderen Websites. Zur leichteren Identifizierung sind im Folgenden häufige oder diagnostisch wichtige Beispiele nach Grammstatus und Form sortiert.

Gram-Färbung Schritt 15

Schritt 4. Identifizieren Sie grampositive Bakterien anhand ihrer Form

Bakterien werden weiter nach ihrer Form unter dem Mikroskop klassifiziert, am häufigsten als Kokken (kugelförmig) oder Stäbchen (zylindrisch). Hier sind einige häufige grampositive (violett gefärbte) Bakterien, die nach Form geordnet sind:

  • Gram-positive Kokken sind im Allgemeinen entweder Staphylokokken (was Kokken in Clustern bedeutet) oder Streptokokken (was Kokken in Ketten bedeutet).
  • Grampositive Stäbchen umfassen Bacillus, Clostridium, Corynebacterium und Listeria. Actinomyces spp. Stäbchen haben oft Äste oder Filamente.
Gram-Färbung Schritt 16

Schritt 5. Identifizieren Sie gramnegative Bakterien

Gram-negative (rosa gefärbte) Bakterien werden oft in drei Gruppen eingeteilt. Kokken sind kugelförmige Bakterien, Stäbchen sind lange, dünne Bakterien und Kokkenstäbchen liegen irgendwo dazwischen.

  • Gram-negative Kokken sind am häufigsten Neisseria spp.
  • Gramnegative Stäbchen umfassen E. coli, Enterobacter, Klebsiella, Citrobacter, Serratia, Proteus, Salmonella, Shigella, Pseudomonas und viele andere. Vibrio cholerae kann als gewöhnliche Stäbchen oder gebogene Stäbchen erscheinen.
  • Gram-negative "kokkoide" Stäbchen (oder "Kokkobazillen") umfassen Bordetella, Brucella, Haemophilus und Pasteurella.
Gram-Färbung Schritt 17

Schritt 6. Bewerten Sie gemischte Ergebnisse

Einige Bakterien sind aufgrund der Zerbrechlichkeit oder Wachsigkeit ihrer Zellwände schwer genau zu färben. Sie können eine Mischung aus lila oder rosa Färbung in derselben Zelle oder zwischen verschiedenen Zellen in demselben Abstrich aufweisen. Jede Bakterienprobe, die älter als 24 Stunden ist, kann dieses Problem haben, aber einige Arten sind in jedem Alter schwer zu färben. Sie können speziellere Tests erfordern, um die Identifizierung einzugrenzen, wie z. B. eine säurefeste Färbung, Beobachtung des Kulturwachstums, TSI-Mediumkulturen oder genetische Tests.

  • Actinomyces, Arthobacter, Corynebacterium, Mycobacterium und Propionibacterium spp. gelten alle als grampositive Bakterien, erscheinen aber oft nicht eindeutig gefärbt.
  • Kleine und schlanke Bakterien wie Treponema, Chlamydia und Rickettsia spp. sind schwer richtig Gram-Färbung.
Gram Fleck Schritt 18

Schritt 7. Materialien entsorgen

Die Verfahren zur Abfallentsorgung variieren je nach Labor und je nach verwendetem Material. Typischerweise wird die Flüssigkeit in der Färbeschale in verschlossenen Flaschen als Sondermüll entsorgt. Weichen Sie die Objektträger in einer 10%igen Bleichlösung ein und entsorgen Sie sie dann in spitzen Behältern.

Tipps

  • Denken Sie daran, dass die Ausbeute bei Gram-Färbung nur so gut ist wie die Probe. Es ist wichtig, den Patienten beizubringen, gute Proben bereitzustellen (z. B. den Unterschied zwischen einem Spucken und einem tiefen Husten bei Sputumproben).
  • Als Entfärber wirkt Ethanol langsamer als Aceton.
  • Befolgen Sie die Standard-Laborvorkehrungen.
  • Verwenden Sie zum Üben einen Wangenabstrich, da die Probe sowohl grampositive als auch gramnegative Bakterien enthalten sollte. Wenn Sie nur den einen oder anderen Typ sehen, verwenden Sie wahrscheinlich zu wenig oder zu viel Entfärber.
  • Sie können eine federartige Wäscheklammer aus Holz verwenden, um die Rutsche zu greifen.

Warnungen

  • Aceton und Ethanol sind brennbar. Aceton entfernt Öle von deinen Händen, wodurch deine Haut andere Chemikalien leichter aufnehmen kann. Handschuhe tragen und mit Vorsicht verwenden.
  • Lasse den Ausstrich nicht trocken werden, bevor du den Fleck oder die Gegenfärbung abspülst.

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